Christina Sahyoun thesis defenceSous la direction du Dr Christian Legros

The December 5, 2024

Jeudi 05 décembre 2024 | 14h00 | Salle RDC IRIS 1.

Proteomic and pharmacological characterization of Montivipera species venoms: Identification of a novel vasorelaxant peptide from Montivipera bornmuelleri venom

Abstract

Hypertension, the leading cause of cardiovascular diseases, is a major contributor to premature death worldwide. Despite available treatments, only 21% of patients have their blood pressure under control, highlighting the need for new therapies. Thus, our study aims to identify and characterize novel anti-hypertensive drugs. Indeed, hypotension is a prominent clinical manifestation upon Viperid snakebites. Hypotensive molecules identified in snake venoms induce arterial vasorelaxation, and consequently reduce systemic vascular resistance and arterial blood pressure. Vipers of the Montivipera genus are endemic to the Near and middle east region. Their venoms are poorly studied and their vasorelaxant effects have not been previously investigated. Additionally, some Montivipera venom proteomics analyses are incomplete, and the results are inconsistent across studies. Thus, our study aimed to pharmacologically characterize the vasorelaxant effects of Montivipera venoms using wire myography technique. Another objective of this study was to isolate the vasorelaxant component(s) from the Lebanese viper, M. bornmuelleri venom using bioassay-guided fractionation. Additionally, our goal was also to conduct a comprehensive proteomics analysis of the following Montivipera venoms using the shotgun proteomics workflow: M. bornmuelleri, M. bulgardaghica, M. albizona, M. xanthina and M. raddei.

Our findings revealed that Montivipera venoms induced strong vasorelaxant effects on isolated mesenteric arteries through different endothelial pathways suggesting the presence of molecules with varying modes of action. Then, we isolated a vasorelaxant PLA₂ from the M. bornmuelleri venom using one-step C18-HPLC, exhibiting its effects via only endothelium-dependent pathways. The isolated Mb-PLA₂ consisted of 121 amino acids with a molecular weight of 13,658.98 Da, determined by MALDI-TOF Mass spectrometry. We then built a 3D structure of Mb-PLA₂ by homology modeling that revealed a conserved structural organization with other PLA₂s of the same group. We also showed that the vasorelaxant effect of Mb-PLA₂ involved NO and EDHF endothelial pathways and we suggested the involvement of both catalytic and non-catalytic activities of Mb-PLA₂ in the observed vasorelaxant effects. In this study, we also performed a proteomics analysis of Montivipera venoms. Our data complemented previous studies, enabling a comparison of the venom proteomes across these species. We identified, in each Montivipera venom, 129 to 179 proteins grouped into 17 to 19 protein families including SVMPs, SVSPs, PLA2s and svVEGFs. This study lays the groundwork for understanding the clinical manifestations of snakebite from these species and guides the development of species-specific antivenoms. It also features the molecular complexity and diversity of these venoms, providing useful libraries for discovering novel molecules.

In conclusion, our study evidenced the heterogeneity of vasorelaxant molecules in Montivipera venoms. Isolating these molecules can provide various isoforms to study vasorelaxant pathways. Additionally, the specific activity of Mb-PLA₂ on the endothelium suggests a novel mode of action for this class of molecules which motivates further investigation including the identification of its molecular target(s) notably, for the development of novel anti-hypertensive treatments.

Keywords: Montivipera venom, Montivipera bornmuelleri, vasorelaxant effects, endothelium, phospholipase A₂, venom proteomics, shotgun.

Résumé

L’hypertension est la principale cause de maladies cardiovasculaires et un facteur majeur de décès prématurés dans le monde. Malgré les traitements disponibles, seulement 21 % des patients parviennent à contrôler leur pression artérielle, ce qui souligne le besoin urgent de nouvelles options thérapeutiques. Dans ce contexte, notre étude vise à identifier et caractériser de nouveaux médicaments antihypertenseurs. En effet, une baisse de la pression artérielle est observée après une morsure de serpent de la famille des Viperidae. Les molécules hypotensives présentes dans leurs venins induisent une vasorelaxation artérielle, réduisant ainsi la résistance vasculaire et la pression artérielle. Les vipères du genre Montivipera, originaires du Proche et Moyen-Orient, ont des venins encore peu étudiés et dont les effets vasorelaxants n’ont pas été explorés. De plus, certaines analyses protéomiques des venins de Montivipera sont incomplètes et leurs résultats varient d’une étude à l’autre.Ainsi, notre étude visait à caractériser pharmacologiquement les effets vasorelaxants des venins de Montivipera via la myographie sur fil. Un autre objectif était d’isoler le(s) composant(s) vasorelaxant(s) du venin de la vipère libanaise, M. bornmuelleri, par fractionnement bio-guidé. Nous avons également cherché à réaliser une analyse protéomique complète des venins suivants de Montivipera en protéomique shotgun : M. bornmuelleri, M. bulgardaghica, M. albizona, M. xanthina et M. raddei.

Nos résultats ont montré que les venins de Montivipera induisaient des effets vasorelaxants importants sur les artères mésentériques isolées par différents mécanismes endothéliaux, suggérant la présence de molécules aux modes d’action variés. En utilisant une C18-HPLC, nous avons isolé une PLA₂ du venin de M. bornmuelleri par présentant des effets vasorelaxants uniquement par des voies endothéliales. Mb-PLA₂ comporte 121 acides aminés avec un poids moléculaire de 13 658,98 Da, déterminé par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Nous avons ensuite construit sa structure 3D par modélisation par homologie, révélant une organisation structurale conservée avec d'autres PLA₂ du même groupe. Nous avons également montré que l’effet vasorelaxant de Mb-PLA₂ impliquait les voies endothéliales NO et EDHF, suggérant que ses activités catalytiques et non catalytiques contribuent aux effets observés.Dans cette étude, nous avons également réalisé une analyse protéomique des venins de Montivipera. Nos résultats complètent les études précédentes, permettant de comparer les protéomes de venins entre ces espèces. Nous avons identifié, dans chaque venin de Montivipera, entre 129 et 179 protéines réparties en 17 à 19 familles, incluant des SVMP, des SVSP, des PLA2 et des svVEGF. Cette étude pose les fondations pour comprendre les manifestations cliniques des envenimations de ces espèces et guide le développement d'anti-venins spécifiques. Elle met aussi en lumière la complexité moléculaire et la diversité de ces venins, offrant des chimiothèques utiles pour la découverte de nouvelles molécules.

En conclusion, notre étude a révélé l'hétérogénéité des molécules vasorelaxantes dans les venins de Montivipera. L'isolement de ces molécules pourrait fournir diverses isoformes pour explorer les voies vasorelaxantes. De plus, l'activité spécifique de Mb-PLA2 sur l'endothélium suggère un nouveau mode d'action pour cette classe de molécules, ouvrant la voie à des recherches supplémentaires, notamment l’identification de ses cibles moléculaires, en vue du développement de nouveaux traitements antihypertenseurs.

Mots-Clés : Venin de Montivipera, Montivipera bornmuelleri, effets vasorelaxants, endothélium, phospholipase A2, protéomique des venins, shotgun